style="width:4.60672in;height:0.66in" /> (2) 本文是学习GB-T 15399-2018 饲料中含硫氨基酸的测定 离子交换色谱法. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了饲料中含硫氨基酸(蛋氨酸、胱氨酸和半胱氨酸)的离子交换色谱法测定法。
本标准适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料和精料补充料中含硫氨基酸的测定。
胱氨酸(含半胱氨酸)和蛋氨酸的定量限均为0.01%。
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6439 饲料中水溶性氯化物的测定
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 14699.1 饲料 采样
GB/T 20195 动物饲料 试样的制备
JJG 1064 氨基酸分析仪
饲料中的含硫氨基酸用过甲酸氧化和盐酸溶液水解生成磺基丙氨酸和蛋氨酸砜，经离子交换色谱
法分离，茚三酮柱后衍生，分光光度法检测，外标法定量。
除特殊说明外，所用试剂均为分析纯。
4.1 水：应符合 GB/T 6682 中一级用水的规定。
4.5 过甲酸溶液 I: 将过氧化氢+甲酸=1+9,混合，并按每毫升添加5 mg
比例加入苯酚，于室温下放 置 1 h,置冰水浴中冷却30 min。 临用现配。
4.6 过甲酸溶液Ⅱ:在过甲酸溶液 I(4.5) 中按每毫升添加3 mg 比例加入硝酸银。
4.7 过甲酸溶液Ⅲ:在过甲酸溶液 I(4.5)
中加入适量硝酸银，每毫升添加量按式(1)计算：
mR≥1.454×m×CN ……………… (1)
式中：
mr— 每毫升过甲酸中硝酸银的量，单位为毫克(mg);
Cx—— 样品中氯化钠含量，%;
m --样品质量，单位为毫克(mg)。
GB/T 15399—2018
4.8 盐酸溶液(6 mol/L): 量取盐酸(4.2)500 mL, 用水稀释至1000 mL, 混匀。
4.9 盐酸溶液(6.8 mol/L): 量取盐酸(4.2)1133 mL 用水稀释至2000 mL, 混匀。
4.10 氢氧化钠溶液(7.5 mol/L): 取氢氧化钠30 g,加水溶解并定容至100 mL。
4.11 柠檬酸钠缓冲液：称取柠檬酸三钠19.6g,用水溶解后加入盐酸16.5 mL,
硫二甘醇5.0 m L,苯酚
1g, 最后加水定容至1000 mL, 过滤。
4.12 偏重亚硫酸钠溶液：称取33.6g 偏重亚硫酸钠加水溶解并定容至100 mL。
4.13 洗脱用柠檬酸钠缓冲溶液：按仪器说明书配制或购买。
4.14 茚三酮溶液：取茚三酮适量，按仪器说明书配制或购买。
4.15
磺基丙氨酸-蛋氨酸砜标准贮备液：准确称取磺基丙氨酸(纯度≥99.0%)105.7 mg
和蛋氨酸砜 (纯度纯度≥99.0%)113.3 mg, 加水溶解并定容至250 mL,
浓度均为2.50 μmol/mL,2℃~8℃ 保存， 有效期1年。
4.16
氨基酸标准储备液：含17种常规蛋白水解液分析用氨基酸(天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨
酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨
酸和精氨酸),各组分浓度均为2.50 μmol/mL, 应使用有证标准溶液。
4.17
混合氨基酸标准工作液：吸取磺基丙氨酸-蛋氨酸砜标准贮备液(4.15)和氨基酸标准贮备液
(4.16)各1.00 mL 置于50 mL
容量瓶中，加柠檬酸钠缓冲液(4.11)定容，混匀。有关各组分浓度均为
50 nmol/mL,2℃~8℃保存，有效期3个月。
5.1 氨基酸自动分析仪：具有阳离子交换柱、茚三酮柱后衍生装置及570 nm 和440
nm 光度检测器。
5.2 分析天平：感量0.1 mg 和0.01 mg。
5.4
旋转蒸发器或浓缩器：可在室温至65℃间调温，控温精度±1℃,真空度可低至3.3×10³Pa
(25 mm Hg)。
5.5 恒温干燥箱：温度可达110℃±2℃。
按 GB/T 14699.1采集有代表性的样品，按 GB/T
20195进行样品制备。粉碎过0.25 mm 孔径筛，
混合均匀，装入密闭容器，备用。
浓缩饲料应首先按GB/T 6439 测定其 NaCl 含量。
平行做两份试验，称取试样50 mg～75 mg(约含蛋白质7.5 mg～25 mg,精确至0.1
mg), 置于 20mL 试管中，于冰水浴中冷却30 min 后加入已冷却的过甲酸溶液
I(4.5), 如样品是浓缩饲料，视其
氯化钠含量加过甲酸溶液[氯化钠含量小于等于3%的加入过甲酸溶液Ⅱ(4.6),氯化钠含量大于3%加
入过甲酸溶液Ⅲ(4.7)]2 mL,
加液时需将样品全部润湿，但不要摇动，盖好瓶塞，连同冰浴一道置于
GB/T 15399—2018
0℃~4℃冰箱中，反应16 h。
以下步骤依使用不同的氧化终止剂而不同：
a) 若以氢溴酸为终止剂：于各管中加入氢溴酸0.3 mL
振摇，放回冰浴，静置30 min, 然后移到旋
转蒸发器或浓缩器(5.4)上，在60℃、低于3.3×10³Pa(25 mm
Hg)下浓缩至干。用盐酸溶 液(4.8)约15 mL 将残渣定量转移到20 mL
安瓿瓶或水解管中，封口或旋紧管盖，置恒温箱
中，110℃±2℃下水解22 h～24 h。
取出安瓶或水解管，冷却，用水将内容物定量地转移至50 mL
容量瓶中，定容。充分混匀，过 滤，取1 mL～2mL
滤液，置于旋转蒸发器或浓缩器中，在低于50℃的条件下，减压蒸发至干。
加少许水重复蒸干2次～3次。准确加入一定体积(2 mL～5mL)
的柠檬酸钠缓冲液(4.11)振
摇，充分溶解后离心，取上清液供仪器测定用。
b)
若以偏重亚硫酸钠为终止剂：则于样品氧化液中加入偏重亚硫酸钠溶液(4.12)0.5
mL, 充分
摇匀后，直接加入盐酸溶液(4.9)17.5 mL 置110℃±2℃恒温箱中水解，水解22
h～24 h。
警示——在水解开始时，不要封安瓿瓶瓶口，或旋动水解管的管帽，待水解1 h
后再封口或旋
紧管帽，否则容易引起水解管爆裂。
取出安瓿瓶或水解管，冷却，用水将内容物转移到50 mL
容量瓶中，用氢氧化钠溶液(4.10)中
和至 pH
约2.2,并用稀释上机用柠檬酸钠缓冲液(4.11)定容，离心，取上清液供仪器测定用。
注：有些氨基酸分析仪，上机试样溶液的 Na+
浓度会影响色谱峰出峰时间或氨基酸的分离，对此需先将水解
液定容过滤，取2mL～5mL 滤液，于50℃下，减压蒸发至约0.5
mL(切勿蒸干),用稀释上机用柠檬酸钠 缓冲液(4.11)将其转移至10 mL
容量瓶中，加氢氧化钠溶液(4.10)调至pH2.2, 并用稀释缓冲液(4.11)定
容。混匀，离心，取上清液供仪器测定用。
使用混合氨基酸标准工作液(4.17)注入氨基酸自动分析仪，适当调整仪器操作程序及参数和洗脱
用缓冲溶液试剂配比，应符合JJG1064
氨基酸分析仪检定规程的要求并保证蛋氨酸砜与天门冬氨酸的
分辨率大于85%,其标准溶液色谱图参照附录 A 的图 A.1。
测定中每5个样品(即10个单样)为一组，
组间插入混合氨基酸标准工作液(4.17)进行校准。以保留时间定性，单点外标法定量。试样中氨基酸
的峰面积应在相应标准工作液该峰面积的30%～200%之间，否则应用柠檬酸钠缓冲液(4.11)稀释后
重测。
试样中胱氨酸(蛋氨酸)含量以其质量分数w
表示，数值以克每100克表示，按式(2)计算：
style="width:4.60672in;height:0.66in" /> (2)
式中：
A,— 试样溶液中磺基丙氨酸(蛋氨酸砜)的峰面积；
V — 试样水解液体积，单位为毫升(mL);
c — 标准工作液中磺基丙氨酸(蛋氨酸砜)浓度，单位为纳摩尔每毫升(nmol/mL);
V;—— 试样溶液进样体积，单位为微升(μL);
n — 试样水解液稀释倍数；
V。——氨基酸标准溶液进样体积，单位为微升(μL);
GB/T 15399—2018
A。 — 氨基酸标准溶液中磺基丙氨酸(蛋氨酸砜)的峰面积；
— 试样质量，单位为毫克(mg);
M— 胱氨酸(蛋氨酸)的摩尔质量，单位为克每摩尔(g/mol)。
(胱氨酸实为胱氨酸与半胱氨酸
之和，以胱氨酸计；其M 酰氨酸=120.2;M 氨酸=149.2)。
以两个平行样品测定结果的算术平均值报告结果，保留两位小数。
在重复性条件下，获得的两次独立测定结果与其算术平均值的差值，当含量不大于0.5%时，不超
过这两个测定值算术平均值的5%;含量大于0.5%时，不超过4%。
style="width:3.10655in" />GB/T 15399—2018
(资料性附录)
氨基酸混合标准溶液的色谱图
磺基丙氨酸和蛋氨酸砜与氨基酸混合标准溶液的色谱图见图 A.1。
style="width:8.86668in;height:4.40682in" />
保留时间/mm
图 A.1 磺基丙氨酸和蛋氨酸砜与氨基酸混合标准溶液(50
nmol/mL) 的色谱图
更多内容 可以 GB-T 15399-2018 饲料中含硫氨基酸的测定 离子交换色谱法. 进一步学习